研究背景

免疫检查点阻断(ICB)疗法通过阻断肿瘤细胞的免疫逃逸机制，重新激活患者体内的免疫反应来对抗癌症。为了有效杀伤肿瘤，CD8 T 细胞可识别由人类白细胞抗原 I 类（HLA-I）分子呈递的肿瘤特异性抗原肽。在人类中，有三个主要的 HLA-I 基因（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）。然而，ICB疗法的响应率并不一致，且存在治疗抵抗性问题。为了提高ICB疗法的预测准确性和治疗效果，研究人员开始探索影响ICB反应的多种因素，包括肿瘤免疫表型、体细胞基因组特征和肠道微生物组等。HLA-I基因型因其在调控免疫应答中的核心地位而备受关注。来自纪念斯隆凯特琳癌症中心的Timothy A. Chan团队提出了一个关键问题：HLA-I基因型是否会影响T细胞对肿瘤抗原的识别能力，进而影响患者对免疫检查点抑制剂的治疗反应? 为了回答这一关键问题，Chan团队设计了一项全面的研究。

研究方法

1. 样本数据：本研究使用了接受ICB治疗的两组癌症患者数据。队列1包含369名接受免疫检查点抑制剂治疗的患者(269例晚期黑色素瘤，100例晚期非小细胞肺癌)的外显子组测序和临床数据；队列2包含1166名来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心的不同类型癌症患者的靶向Panel测序数据和临床数据。

2. HLA I类基因分型：本研究通过高准确性工具Polysolver直接分析正常生殖细胞的外显子组测序数据，或者使用经过临床验证的HLA分型检测方法（如LabCorp的检测服务）来执行高分辨率的HLA I类基因分型。此外，对于队列1，使用HLA-SOAP进行了HLA II类基因分型。

3. 统计分析：使用Kaplan-Meier estimator进行生存分析，采用log-rank检验统计显著性，使用单变量或多变量Cox回归计算风险比。基于全外显子测序的非同义突变总数计算肿瘤突变负荷，并使用R函数test设定截断值，将患者分为高低两组。采用wilcoxon-秩和检验比较HLA纯合子组和杂合子组间的体细胞突变数以及治疗中TCR CDR3克隆性。

4. 突变分析：对于队列1，分析按DePristo等人描述的方法进行。FASTQ格式的配对末端读段使用Burrows-Wheeler比对器与参考人类基因组GRCh37进行比对，利用GATK进行局部重新比对，使用Picard去除重复读段。使用整合了四种突变调用器的pipeline（MuTect、Strelka、SomaticSniper和Varscan）识别体细胞单核苷酸变异（SNVs）。等位基因读数少于4或相应正常覆盖度少于7个读段的SNVs被过滤掉。使用由三个调用器（Strelka、VarScan和Platypu）组成的pipeline识别小插入和缺失（indels）。对于队列2，相对突变负荷使用MSK-IMPACT确定。

5. HLA I类基因杂合性丧失分析：使用FACETS进行拷贝数变异分析，以确定等位基因特异性拷贝数。识别包含HLA-A、HLA-B和HLA-C位点的染色体6p位点内的片段。使用expectation-maximization model，将任何HLA位点的次要等位基因拷贝数估计为0定义为杂合性丧失（LOH）。

6. TCR β链测序和分析：研究对治疗中（Nivolumab启动后4周）收集的肿瘤样本子集进行了测序（TCR-seq）。随后计算了TCR CDR3谱系的clonality，定义为均匀度的补数（即1-均匀度）。均匀度定义为观察到的Shannon熵（H）除以给定群体中唯一元素数量的最大可能H（4）。从Adaptive Biotechnologies获得了单个TCR序列的数据，包括V和J基因段识别和CDR3序列，用于T细胞谱系的自定义分析。对每个观察到的VJ组合，单独分析了由单个VJ盒组合编码的CDR3氨基酸序列的克隆性。

7. HLA I类结构分析和分子动力学模拟：使用VMD Mutator插件突变PDB 1M6O中pHLA复合物中的新抗原结构，以符合所需的B44基序（F3I、P4G、A6V、F9Y）。所有图像均使用VMD软件包进行渲染。分离的HLAI类等位基因和HLA肽复合物的分子动力学（MD）模拟来自最高可用分辨率的晶体结构：HLA-B*15:01（PDBID:1XR9)；HLA-B*07:02（PDBID:5EO0)；和HLA-B*53:01（PDBID:1A1M)；所有的MD模拟都使用NAMD软件包进行模拟。使用GROMACS 软件套件中包含的标准工具计算残差间分离和残差位置均方根波动（RMSFs）。

研究结果

1. HLA-I杂合性显著提高ICB治疗患者的生存率： 本研究通过对1535名接受ICB治疗的癌症患者的HLA-I基因型进行分析，发现与至少有一个HLA位点为纯合子的患者相比，HLA-I位点的最大杂合度（“A”、“B”和“C”）提高了ICB治疗后的总生存率（图1A-C）。HLA-I纯合性与低突变负荷强烈相关，与杂合性高突变负荷的患者相比，生存率降低（图1D-G）。HLA-I基因的杂合性丧失（LOH）的患者生存率降低，且对肿瘤突变负荷低的患者生存率影响更大。此外，HLA杂合子患者表现出更高的TCR CDR3克隆性（图3F，G）。

图1.  HLA-I纯合性对ICB治疗患者生存率的影响。(A，B) 队列1/2中至少一个HLA-I位点的纯合性与OS降低相关；(C)所有1535例患者的HLA-I纯合性与OS降低相关；(D，E)在两个队列中分别比较了具有杂合HLA-I位点且高突变负荷的患者与具有纯合HLA-I位点且低突变负荷的患者的生存率，发现杂合性且高突变负荷的患者生存率更好；(F，G)HLA-I杂合性和突变负荷对生存率的联合影响比单独的突变负荷更大；(H)HLA-I的LOH与ICB治疗患者的OS降低相关；(I)低突变负荷肿瘤中的LOH相对高突变负荷和无LOH肿瘤对预后影响更大。

2. HLA-B44超型对总生存率的影响：在两个独立的黑色素瘤队列中，将HLA-I等位基因分类为12个不同的超型（图2A，B）， 发现HLA-B44超型患者对延长生存期效果显著（图2C，D），尤其是在考虑体细胞突变负荷时（图2E-H）。

图2.  HLA-B44超型对ICB治疗的黑色素瘤患者生存的影响。(A，B)队列1/2中黑色素瘤患者中不同HLA超型的患病率；(C，D)对队列1/2中携带B44等位基因（B44(+)）与不携带B44等位基因（B44(-)）的患者的生存情况；(E，F)对队列1/2中携带B44等位基因且具有高突变负荷的患者与不携带B44等位基因且具有低突变负荷的患者的生存情况；(G，H)B44等位基因和突变负荷对生存率的联合影响比单独考虑突变负荷更大；(I)TCGA队列中B44等位基因与生存率无显著关联；(J)B44等位基因中常见的肽基序与已知的免疫原性新抗原相关联。

3. HLA-B62超型与不良预后相关：B62超型与生存率的负相关性主要由HLA-B*15:01等位基因驱动（图3A）。通过三维结构分析发现其在肽结合槽中具有独特的结构桥（图3B，C）。分子动力学（MD）模拟显示，与其他HLA-B等位基因相比，HLA-B*15:01在结合肽段时保持了结构桥的完整性，并且桥接残基变得更不灵活，这可能影响T细胞受体对新表位的有效识别（图3D，E）。

图3.  HLA-B*15:01等位基因对ICB治疗患者生存率的影响。(A) HLA-B*15:01等位基因的患者生存率降低；(B) HLA-B*15:01、结合肽和桥接残基的肽结合槽三维结构；(C) 在结合肽残基位置P2和P3上的桥接隔离效应的侧视图；(D、E) 分离的HLA B*15:01分子及其与UBCH6肽的复合物的MD模拟快照，肽存在时桥接残基的RMSFs增加；(F、G)治疗期间，HLA杂合患者的TCR CDR3克隆性更高。

结论

通过对1535名接受ICB治疗的癌症患者的HLA-I基因型分析，HLA-I位点杂合性提高了ICB后的总生存期，且HLA-B44超型患者生存期延长，而 HLA-B62超型（包括HLA-B*15:01）或HLA-I时体细胞杂合性缺失与不良预后相关。HLA-B*15:01的分子动力学模拟揭示了可能损害CD8 T细胞对新抗原识别的不同元素。本研究结果对于预测对ICB的反应和基于新抗原的治疗性疫苗的设计具有重要意义。总的来说，这项研究为理解HLA-I基因型在癌症免疫治疗中的作用提供了新的视角，并为未来的癌症治疗策略提供了重要的指导。随着免疫治疗的不断发展，深入理解这些遗传因素如何影响治疗效果，将有助于实现更个性化、更有效的癌症治疗。

参考文献

Diego Chowell et al. ,Patient HLA class I genotype influences cancer response to checkpoint blockade immunotherapy. Science359,582-587(2018).DOI:10.1126/ science.aao4572

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